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- PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
- PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
- PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 - 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
- 实验试剂与器材
- 模板DNA、2.5mmol/L dNTP
- Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物
- 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
- PCR仪、移液枪、PCR板
- 配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：
- 模板DNA 2μL
- 引物1 1μL
- 引物2 1μL
- dNTP 1.5μL
- MgCl2 2μL
- 10×buffer 2μL
- ddH2O 10μL
- Taq酶 0.5 新技术推荐
使用 2D-梯度技术优化 β-Actin 基因的扩增。
2D-梯度技术允许在一次反应中同时对退火温度（从下向上）和变性温度（从左向右）进行优化。较高的的变性温度可以提高反应特异性，而较低的变性温度则可以减少对生物分子的压力，从而提高产量。 如果使用 95 °C 变性温度的反应效果不理想，通过优化变性温度可得到明显的改善。
设置PCR反应程序
扩增产物的电泳检测
注意事项
- 1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
- 2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
- 3. 不使用过量试剂“less is usually better （more specific）”。
- 4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
- 5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
- 6. 使用阴性对照检查污染的发生。
- 7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
- 8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
- 9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
- 10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
- 11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 PCR技术应用
- 1、生命科学 a、人类基因组计划 随着的PCR日臻完善，科学家于2003年在完成的人类基因组“工作框架图”的基础上，经过整理、分类和排列后得到的更加准确、清晰、完整的基因组图谱。这是对人类基因组基本面貌的首次揭示，表明科学家们开始部分“读”出人类生命“天书”所蕴涵的内容。
b、后基因组计划 人类基因组DNA序列图谱完成后，鉴定基因组多态性及其单倍型以及寻找其在生物和医学应用中重要成为人们关心的热点。以研究基因功能为核心的“后基因组时代”已经来临，大规模的结构基因组、蛋白质组以及药物基因组的研究计划已经成为新的热点。
c、物种的分类、进化及亲缘关系 可以进行物种进化的保守性分析及物种多态性分析、物种鉴定。
2、医药
- a、疾病的诊断和治疗 遗传性疾病 。
- b、致病病原体的检测 包括细菌、病毒
- c、DNA指纹、个体识别
- d、生物工程制药
- e、转基因动物制药及疾病模型 3、农业科学
- a、转基因植物 按其功能主要分提高产量、抗病力、抗除草剂、改良品质和发育调节。如:大豆、玉米、马铃薯、番茄等。
- b、转基因动物 在农业方面，主要在改良畜禽生产性状,提高畜禽抗病力及利用转基因畜禽生产非常规畜产品。4、考古学及历史事件解读
- 利用人类短串联重复STR-PCR技术，研究人类种族的遗传多态性，效果非常稳定。目前此技术已广泛用于生物考古、种系发育、民族学、人类学和考古学等各个领域中。
a、食品微生物的检测 传统的致病菌检测首先经过长时间的培养，费时费力，应用PCR技术则非常迅速、准确。主要用于：食品致病菌的检测，如肉毒唆菌等；乳酸菌的检测；水中细菌指标测定。
b、转基因食品的检测 目前世界转基因食品已经有100多物种，大多数已经用于食品。转基因食品对人体健康的危害及对生态的影响也日受世界广泛的重视，因此对转基因食品的检测成为控制其泛滥的一种手段。
c、动、植物检疫 灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫，检查出入国门的人员、动、植物（种畜、种籽）等是否携带烈性传染病（艾滋、动物病毒、植物病毒等）病原体，食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外，是提高我国综合国力的必要保证。
